Шляхи вдосконалювання методу лікування ран пересадженням вирощених in vitro кліток шкіри

>Лікування хвороб Опіки

Метод відновлення шкірного покриву, запропонований Гріном і співавторами, постійно вдосконалюється [Garcia Fernandez E. et al., 1995]. Головним чином, це стосується технології культивування кліток. Метод має ряд недоліків, одним із яких є більша тривалість культивування кліток (18-24 сут. і більше), що обмежує можливості його застосування для лікування потерпілих. Іншим недоліком є висока складність технології пересадження кліток. Вирощені на поверхні культураль-них посудин епітеліальні шари необхідно за допомогою ферментативної обробки відокремити від поверхні й, закріпивши на спеціальному носії (парафинизированной марлі), перенести на раневую поверхня. У результаті дії ферменту відбувається скорочення площі вирощеного шару, ушкоджуються клітки й міжклітинні зв'язки, що негативно впливає на приживлення епидермаль-них шарів. Після зняття шару з подложки останній може деформуватися, його необхідно розправити й фіксувати на якому-небудь носії. Для підвищення механічної міцності він повинен бути багатошаровим, а це неминуче збільшує тривалість культивування кератиноцитов. Навіть невеликі відхилення в технології ферментної обробки зводять нанівець всю раніше проведену роботу

УДОСКОНАЛЮВАННЯ ПРОЦЕДУРИ ЗНЯТТЯ Й ПЕРЕНОСУ КЛІТИННОГО ШАРУ З ПОВЕРХНІ КУЛЬТУРАЛЬНОГО ПОСУДИНИ НА РАНИ

Зберегти життєздатність кератиноцитов на цьому етапі можна двома способами. Перший припускає відпрацьовування рецептур, що дозволяють відкріплювати клітинні шари без ушкодження кліток. Другий напрямок - це виключення самої процедури ферментної обробки за рахунок застосування подложек, на яких можна культивувати й трансплантировать на рани МПК. V. Ronfard і соавт. (1991) як подложки для вирощування кератиноцитов використовували фібриновий гель. Після формування шарів гель із клітками виймали із чашок Петри й переносили на раневие поверхні. Незважаючи на те, що харчування базальних кліток було трохи утруднене, через 10-15 днів після трансплантації формувався стратифікований епидермис. Цей спосіб останнім часом стали використовувати широко [Rives J., Carsin H., 1995].

Н. Kaizer і соавт. (1994) трансплантировали аутологичние кера-тиноцити на поверхні фібринового матрикса й поверх них накладали розщеплені шматки аллокожи, консервованої в гліцерині. У такий спосіб ними були закриті рани на площі від 3 до 15% поверхні тіла. Якість відновленої шкіри бути цілком задовільним. Відомі й інші варіанти пластики. J. Корр і соавт. (1995) суспензію кератиноцитов у фібриновому клеї переносили на рани й поверх клітинної культури накладали перфоровану (але не розтягнуту) аллогенную шкіру

Для переносу на рани кліток можливий і інший підхід. При цьому на поверхні пленкивиращивается один шар кератиноцитов (або фібробластів), що у положенні головою-долілиць пересаджується на поверхню ран. У наших дослідженнях ми використовуємо плівку Фолидерм, на поверхні якої добре відбувається проліферація кліток (див. мал. 7.19 і 7.20). Після аплікації на рану плівка захищає пересаджені клітки від висихання й від інфекції. Живий еквівалент шкіри (ЖЕК), запропонований Е. Bell і соавт.

(1983) дотепер не знайшов широкого клінічного застосування для лікування обпалених. Це пов'язане з тим, що одержання живого еквівалента шкіри є ще більш складною технологією

Для виключення етапу ферментної обробки й полегшення процедури трансплантації клітинної культури на раневое ложі нами був запропонований метод культивування кератиноцитов на поверхні мікроносіїв, опис якого приводиться нижче.

КУЛЬТИВУВАННЯ Й ТРАНСПЛАНТАЦІЯ КЕРАТИНОЦИТОВ І ФІБРОБЛАСТІВ НА ПОВЕРХНІ МІКРОНОСІЇВ

Кератиноцити й фібробласти ставляться до кліток, життєздатність яких залежить від субстрату ( anchorage-dependent cells). Щоб пролиферировать, їм необхідно прикріпитися до поверхні подложки.

Як було відзначено вище, для лікування великих опіків існує необхідність нарощування великої клітинної маси. Вирощування кератиноцитов на плоскій подложке не дозволяє вирішити це завдання в повному обсязі. Більше технологичним є вирощування кліток на мікроносіях (МН), що представляють собою дрібні частки, до яких прикріплюються клітки, і які можуть перебувати в живильному в зі зваженому стані

На думку S. Reuveny (1985), переваги цього методу полягають у наступному:

При вирощуванні на МН досягається більше високий рівень відносини площі поверхні субстрату, до якого прикріплюються клітки, до обсягу культурального посудини. Збільшити це співвідношення можна простою зміною концентрації мікроносіїв у флаконі. Існує можливість виростити до 9 млн кліток в 1 мол живильній среди.

Ріст кліток може здійснюватися в одній посудині (високопродуктивному) замість декількох малопродуктивних, що істотно знижує вартість культивування

Створюються кращі умови для моніторингового контролю за станом середовища в культуральном посудині (рн, рс02 і т.д.), що дозволяє досягати більше відтворених результатів

Існує можливість узяття невеликих проб клітинного матеріалу для дослідження

Процедура зняття клітинного матеріалу полегшується

Стає можливим здійснювати трансплантацію кліток на поверхні МН без ферментної обробки

Існує принципова можливість культивувати клітки в промислові масштабах

У цей час розроблені численні види мікроносіїв, які застосовуються в біотехнології (Biocarrier; Cytodex-1, Cytodex-2, Cytodex-3; Superbeads, Ventragel; Geliibeads; Biosilon; Cytospheres; DE-53 і др.). Мікроносії можуть бути пустопорожніми (зі скла), мати щільний або пористий матрикс, а також поверхневий шар (покриття) з різних біологічно активних матеріалів (желатин, коллаген, ламинин, фибронектин, полілізин і ін.).

Всі мікроносії відрізняються по своєму складі, по типі покриття й за технологією одержання. Залежно від хімічного складу МН можуть мати різну консистенцію й електростатичний заряд поверхні. У кератиноцитов заряд негативний, і тому вони найкраще прикріплюються до мікроносіїв, що мають позитивний заряд поверхні. На мікроносіях можна культивувати різні типи кліток. Разом з тим, донедавна в науковій літературі були відсутні дані про можливість культивування кератиноцитов на поверхні МН.

Нами, разом зі співробітниками лабораторії по вивченню клітинної проліферації (НДІ біології розвитку, зав.- д-р біол. наук В. В. Терских), проведені дослідження з визначення можливості вирощування кератиноцитов на поверхні МН, у результаті яких установлене, що для культивування кліток шкіри серед доступних видів мікроносіїв найкраще підходять мікроносії Цитолар і Цитопол (мал. 7.25). Культивування КЦ здійснювали в середовищі, склад якого ідентичний такий, використовуваної для вирощування їх на плоскому субстраті. Принципова схема методу наведена на мал. 7.26.

Необхідно також відзначити, що крім кератиноцитов на поверхні МН можуть культивуватися й інші види кліток, наприклад, фібробласти. Мікроносії із прикріпленими до них клітками переносять на поверхню ран. Потім клітки (кератиноцити або фібробласти) сповзають із МН і пролиферируют на ранах

При аналізі характеру росту кліток на поверхні МН установили наступне. Кератиноцити мають різний ступінь рас-пластанности й місцями формують багатошарові конгломерати (мал. 7.27). При цьому периферична частина кератиноцитов сильно розпластується, а на ній перебувають КЦ із верхнього ряду, які у свою чергу розпластуються й своєю периферичною частиною сповзають на поверхню мікроносія. У такий спосіб формується багатошарова структура

Цікаво, що в культурі, що не досягла конфлюентности, міжклітинні зв'язки слабкі. У досліджуваних пробах відсутні зрілі десмосоми й полудесмосоми, зустрічаються тільки формуються

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Современная стоматология – отзывы, профилактика, методы лечения и восстановление зубов